作為極具前景的治 療藥物，寡核苷酸已成為全 球研發(fā)和投資的重 點(diǎn)領(lǐng)域。寡核苷酸受到合成反應(yīng)效率和原料純度等多重因素的影響，在合成過程中會產(chǎn)生多種不同的雜質(zhì)。反相色譜、離子交換等是對寡核苷酸粗品純化的常用色譜手段。
寡核苷酸純化工藝，需要充分考慮產(chǎn)品純度和回收率之前的平衡，有效的純化放大策略有利于工藝開發(fā)和制備放大的順利進(jìn)行。下圖 1 展示了典型純化工作流程。
圖 1. 采用安捷倫自動純化軟件實(shí)現(xiàn)自動化純化工作流程
安捷倫針對寡核苷酸制備，主要工作流程包括：
1、在分析柱上，進(jìn)行目標(biāo)化合物確認(rèn)和分析方法篩選；
2、將分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入到自動純化軟件中，指定目標(biāo)化合物并生成“聚焦”制備梯度；
3、在制備柱上進(jìn)行純化；
4、自動純化軟件將需要分析的餾分自動生成序列表，以進(jìn)行餾分分析和純度確認(rèn)。
寡核苷酸分析到純化實(shí)例
本實(shí)例采用了安捷倫 1290 Infinity II 自動放大 LC/MSD 系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有以下特性：
圖 2. 安捷倫 1290 Infinity II 自動放大 LC/MSD 系統(tǒng)
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在一套系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)從分析到制備的放大，提高制備通量
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自動餾分延遲傳感器技術(shù)，以及極低的峰擴(kuò)散和交叉污染，提高餾分的純度和回收率
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自動純化軟件使工作流程能夠從分析自動放大至制備，無需進(jìn)行方法開發(fā)
對于寡核苷酸純化，安捷倫 AdvanceBio 寡核苷酸系列色譜柱是首 選。這類柱子使用了 Agilent InfinityLab Poroshell 技術(shù)，并且鍵合了高 pH（HPH）鍵合相。不僅能在較高 pH 和溫度下使用，每批 AdvanceBio 寡核苷酸色譜柱還會進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，以實(shí)現(xiàn) n/ (n–1) 寡核苷酸分離。本實(shí)例使用色譜柱：
分析柱
Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18, 3 × 100 mm，2.7 μm（貨號 695975-502）
制備柱
Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色譜柱，21.2 × 150 mm，4 μm（貨號 671150-702）
本實(shí)例樣品
濃度 3.1 mmol/L，溶于 20 mmol/L PBS 中的寡核苷酸樣品。
本實(shí)例工作流程
1、在分析柱上，進(jìn)行目標(biāo)化合物確認(rèn)和分析方法篩選
表 1. 分析運(yùn)行的色譜條件，HA/HFIP 法
使用 HPLC/MS 方法（HA /HFIP，二乙胺/六氟異丙醇，見表 1）分析樣品（見圖 3）。
圖 3. 使用 HA/HFIP 和優(yōu)化的梯度分離樣品
根據(jù)分析結(jié)果提取質(zhì)譜圖，確定寡核苷酸分子量 10704Da。利用 OpenLab ChemStation 中的解卷積工具計(jì)算分子量，將信號與電荷數(shù)關(guān)聯(lián)（圖 4）。在制備時(shí)多電荷離子可用來觸發(fā)餾分收集。
圖 4. 通過解卷積計(jì)算寡核苷酸分子量和多電荷離子（A：電荷數(shù)）
考慮到制備在高流速運(yùn)行下的溶劑成本，開發(fā)了一個不需要用到 HFIP 這類價(jià)格較高溶劑的方法（DBA-TRIS，二丁胺-TRIS），見表 2。
表 2. 分析和制備運(yùn)行的色譜條件, DBA-TRIS 法
用 DBA/TRIS 分離的分析圖譜見圖 5。
圖 5. 使用 DBA/TRIS 和通用梯度分離寡核苷酸
2、將分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入到自動純化軟件中，指定目標(biāo)化合物，自動生成制備聚焦梯度
將分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入自動純化軟件中，點(diǎn)擊設(shè)定目標(biāo)峰，自動純化軟件就能自動生成制備聚焦梯度，見圖 6。
圖 6. 為寡核苷酸計(jì)算制備聚焦梯度
3、在制備柱上進(jìn)行純化
定義觸發(fā)餾分收集的目標(biāo)質(zhì)量數(shù)，用聚焦梯度進(jìn)行純化。圖 7 顯示了制備分離和餾分收集的情況，共收集了八個餾分片段。
圖 7. 使用 DBA/TRIS 和聚焦梯度對寡核苷酸進(jìn)行制備純化
4、通過自動純化軟件餾分導(dǎo)出工具，將需要分析的餾分生成序列表進(jìn)行分析
圖 8. 寡核苷酸純化收集的八個餾分分析的色譜圖疊加
餾分再分析的結(jié)果見圖 8。第 一個餾分（藍(lán)色標(biāo)記）含雜質(zhì)，其余所有餾分純度均 >99%。質(zhì)譜觸發(fā)的選擇性收集，使得餾分純度更高。
